一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片及方法与流程

文档序号:19583817发布日期:2019-12-31 20:21
一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片及方法与流程

本发明涉及生物样品处理狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台领域,特别涉及一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片及方法。



背景狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台:

微流控狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台在最近二十年得到迅速发展,微流控芯片也俗称“芯片实验室”,可以将样品的制备、处理、传输以及反应等过程集中在一个平方厘米级的芯片上,减小实验设备尺寸,降低试剂消耗量。因此越来越多微流控狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台被应用于细胞的分选,其中包括介电泳操纵、流体惯性力操纵、微流控微滤膜方法、磁操纵以及声场力操纵。在这些狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台中,声表面波操纵微粒控制精确、非标记、非侵入并且具有良好的生物兼容性,在生物粒子操纵方面具有良好的应用前景。声表面波是一种沿着压电基底表面传播的声波,其特点是声波能量汇聚于基底表面,可实现对基底表面流体的操控,具有高效的流固耦合特性,因此在微流控领域得到广泛的应用。

目前出现与声表面波相关的血细胞分选的研究有:j.nam等人在微流控芯片中利用声表面波驻波场偏转白细胞和红细胞,实现对血小板的分选,收集纯度约为98%(j.nam,h.lim,d.kim,s.shin,separationofplateletsfromwholebloodusingstandingsurfaceacousticwavesinamicrochannel,labonachip,2011,11,3361.);tonyjunhuang等人在微流控芯片中利用声表面波实现白细胞在红细胞碎片中的分选以及清洗(s.li,x.ding,z.mao,y.chen,n.nama,f.guo,p.li,lwang,c.e.cameronbc,t.j.huang,standingsurfaceacousticwave(ssaw)-basedcellwashing,labonachip,2015,15,331.);tonyjunhuang等人发明一种利用声波高速分选血小板的微流控芯片,该芯片通过剔除白细胞和红细胞而完成对血小板的分选,流体通量比之前基于声波分选血小板的方法高出2500倍(y.chen,m.wu,l.ren,j.liu,pamelah.whitley,l.wang,t.j.huang,high-throughputacousticseparationofplateletsfromwholeblood,labonachip,2016,16,3346.)。

以上方法虽然成功应用于血细胞分选,但仅限于对单一种类血细胞的分选,还不能够在一个微流控芯片上同时完成对白细胞、红细胞以及血小板的分选,另外这些基于声表面波对血细胞进行分选的方法大多数是利用驻波场,其偏转血细胞的距离受到驻波节点限制。



狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台实现要素:

为了克服上述现有狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台的缺点,本发明的目的在于提出一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片及方法,利用两组叉指换能器,结合两级分选微流道,通过施加不同的频率及电压,实现对白细胞、红细胞以及血小板的依次分选,同时利用声表面波行波场提高了血细胞分选效率,具有良好的生物医学应用价值。

为了实现上述目的,本发明采用如下狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台方案:

一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片,包括压电基底1,压电基底1上溅射两组叉指换能器,在压电基底1上且位于两组叉指换能器一侧键合有pdms微流道系统。

所述的pdms微流道系统包括第一鞘流液流入通道4,第一鞘流液流入通道4的入口端连接鞘流液流进接头,第一鞘流液流入通道4的出口端连接白细胞分选流道7的入口端;白细胞分选流道7的入口端和血细胞样品液流入通道5的出口端连接,血细胞样品液流入通道5的入口端连接血细胞样品液流进接头;白细胞分选流道7的入口端和第二鞘流液流入通道6的出口端连接,第二鞘流液流入通道6的入口端连接鞘流液流进接头;白细胞分选流道7的出口端连接白细胞收集通道8的入口端,白细胞收集通道8的出口端连接白细胞出口接头;

白细胞分选流道7的出口端连接红细胞与血小板流入通道9的入口端,红细胞与血小板流入通道9的出口端连接红细胞分选流道11的入口端;

红细胞分选流道11的入口端和第三鞘流液流入通道10的出口端连接,第三鞘流液流入通道10的入口端连接鞘流液流进接头;红细胞分选流道11的出口端连接红细胞收集通道12的入口端,红细胞收集通道12的出口端连接红细胞收集接头;红细胞分选流道11的出口端连接血小板收集通道13的入口端,血小板收集通道13的出口端连接血小板收集接头。

所述的两组叉指换能器包括第一组叉指换能器2和第二组叉指换能器3,第一组叉指换能器2和第二组叉指换能器3与pdms微流道系统的相对位置为:第一组叉指换能器2的叉指与白细胞分选流道7平行,第一组叉指换能器2与白细胞分选流道7的垂直距离为1mm,声孔径在白细胞分选流道7长度范围内作用;第二组叉指换能器3的叉指与红细胞分选流道11平行,第二组叉指换能器3与红细胞分选流道11的垂直距离为1mm,声孔径在红细胞分选流道11长度范围内作用。

所述的两组叉指换能器包括若干对叉指。

所述的第一组叉指换能器2包括100对叉指,指条宽度为20um,声孔径为2mm;所述的第二组叉指换能器3包括100对叉指,指条宽度为10um,声孔径为2mm。

所述的pdms微流道系统中所有流道的高度均为70um,流道各部分的宽度如下:第一鞘流液流入通道4宽度为150um,血细胞样品液流入通道5宽度为300um,第二鞘流液流入通道6宽度为250um,白细胞分选流道7宽度为500um,白细胞收集通道8宽度为300um,红细胞与血小板流入通道9宽度为240um,第三鞘流液流入通道10宽度为300um,红细胞分选流道11宽度为500um,红细胞收集通道12宽度为300um,血小板收集通道13宽度为240um;其中第一鞘流液流入通道4、第二鞘流液流入通道6、白细胞收集通道8、第三鞘流液流入通道10、红细胞收集通道12均为圆弧形流道,血细胞样品液流入通道5、白细胞分选流道7、红细胞与血小板流入通道9、红细胞分选流道11和血小板收集通道13均为直流道。

所述的压电衬底1材料为128°y切铌酸锂。

所述的两组叉指换能器均采用50纳米底层铬和200纳米上层金的双层结构。

所述的一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片的分选方法,包括以下步骤:

1)将基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片固定在显微镜的载物台上,在目镜下观察确定白细胞分选流道7和红细胞分选流道11在显微镜视场内;

2)将第一鞘流液流入通道4连接的鞘流液流进接头、第二鞘流液流入通道6连接的鞘流液流进接头、第三鞘流液流入通道10连接的鞘流液流进接头通过特氟龙导管分别与氮气压力注射泵上的三个pbs溶液储液瓶相连接,将血细胞样品液流入通道5连接的血细胞样品液流进接头通过特氟龙导管与氮气压力注射泵上的待分离血细胞样品液储液瓶相连接,将白细胞出口接头、红细胞收集接头、血小板收集接头通过特氟龙导管分别与白细胞收集容器、红细胞收集容器、血小板收集容器相连接;

3)将两台信号发生器的信号输出口的正负两极分别与第一组叉指换能器2和第二组叉指换能器3的正负两极相连接,调节两台信号发生器的输出信号为正弦连续输出,连接第一组叉指换能器2的信号发生器输出电压为20-40vpp,输出频率为48.5mhz;连接第二组叉指换能器3的信号发生器输出电压为20-40vpp,输出频率为99mhz;

4)开启注射泵,通过调节第一鞘流液流入通道4、血细胞样品液流入通道5、第二鞘流液流入通道6以及第三鞘流液流入通道10入口端压力,使血细胞样品液和鞘流液形成稳定层流,然后打开信号发生器输出开关,进行全血细胞分选。

所述的一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片的制备方法,包括下列步骤:

1)利用光刻狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台在洁净的铌酸锂衬底表面制作一层带有两组叉指换能器图案的光刻胶;

2)采用溅射+剥离的工艺在铌酸锂衬底表面制作两组叉指换能器;

3)采用光刻狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台在硅衬底上制作su8模具;

4)利用su8模具制作pdms材质的pdms微流道系统,并进行出入口接头处理;

5)将经等离子体清洗的pdms微流道系统与铌酸锂衬底对齐后在150℃保温2小时后完成键合。

相对于现有狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台,本发明具有以下有益效果:

(1)本发明利用声表面波狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台在微流控全血细胞多级分选芯片中进行全血细胞分选,不仅充分利用声表面波能量密度高、非标记、非侵入以及具有良好生物兼容性的特点,而且将整个全血细胞分选过程集中在一个平方厘米级的芯片上,缩小实验设备尺寸,减少试剂消耗量,降低分选成本。

(2)本发明在一个微流控全血细胞多级分选芯片上利用两组叉指换能器实现了对白细胞、红细胞以及血小板的依次分选,打破之前利用声表面波进行单种血细胞分选的局限性。

(3)本发明利用声表面波的行波场实现对血细胞的分选,行波偏转细胞的距离是声波波长几倍,不受声波节点距离限制,分选效果明显,克服之前利用声表面波驻波场偏转目标细胞距离只能为1/2波长的缺陷。

附图说明

图1是本发明基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片的结构示意图。

图2是本发明基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片的原理图。

图3a是全血细胞在分选过程中白细胞分选流道的局部放大图;图3b是全血细胞在分选过程中红细胞分选流道的局部放大图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细叙述。

参照图1和图2,一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片,包括压电基底1,压电基底1上溅射两组叉指换能器,在压电基底1上且位于两组叉指换能器一侧键合有pdms微流道系统。

所述的pdms微流道系统包括第一鞘流液流入通道4,第一鞘流液流入通道4的入口端连接鞘流液流进接头,第一鞘流液流入通道4的出口端连接白细胞分选流道7的入口端;白细胞分选流道7的入口端和血细胞样品液流入通道5的出口端连接,血细胞样品液流入通道5的入口端连接血细胞样品液流进接头;白细胞分选流道7的入口端和第二鞘流液流入通道6的出口端连接,第二鞘流液流入通道6的入口端连接鞘流液流进接头;白细胞分选流道7的出口端连接白细胞收集通道8的入口端,白细胞收集通道8的出口端连接白细胞出口接头;

白细胞分选流道7的出口端连接红细胞与血小板流入通道9的入口端,红细胞与血小板流入通道9的出口端连接红细胞分选流道11的入口端;

红细胞分选流道11的入口端和第三鞘流液流入通道10的出口端连接,第三鞘流液流入通道10的入口端连接鞘流液流进接头;红细胞分选流道11的出口端连接红细胞收集通道12的入口端,红细胞收集通道12的出口端连接红细胞收集接头;红细胞分选流道11的出口端连接血小板收集通道13的入口端,血小板收集通道13的出口端连接血小板收集接头;

第一鞘流液流入通道4、第二鞘流液流入通道6、第三鞘流液流入通道10分别通入鞘流液,血细胞样品液流入通道5通入血细胞样品液,三相流体在白细胞分选流道7形成第一稳定层流ⅰ,在红细胞分选流道11形成第二稳定层流ⅱ;白细胞收集通道8出口端用于收集白细胞,红细胞收集通道12出口端用于收集红细胞,血小板收集通道13用以收集血小板。

所述的两组叉指换能器包括第一组叉指换能器2和第二组叉指换能器3,第一组叉指换能器2和第二组叉指换能器3与pdms微流道系统的相对位置为:第一组叉指换能器2的叉指与白细胞分选流道7平行,第一组叉指换能器2与白细胞分选流道7的垂直距离为1mm,声孔径在白细胞分选流道7长度范围内作用;第二组叉指换能器3的叉指与红细胞分选流道11平行,第二组叉指换能器3与红细胞分选流道11的垂直距离为1mm,声孔径在红细胞分选流道11长度范围内作用;第一组叉指换能器2和第二组叉指换能器3均在pdms微流道的同一侧,第一组叉指换能器2在白细胞分选流道内所产生的声辐射力实现白细胞与红细胞、血小板的分选,第二组叉指换能器3在红细胞分选流道所产生的声辐射力实现红细胞与血小板的分选,两组叉指换能器在垂直方向上尽可能靠近pdms微流道系统主要为了减少声波能量损失。

所述的两组叉指换能器均包括若干对叉指,根据逆压电效应在压电基底上产生声表面波,声表面波在微流道内实现对细胞的操纵。

所述的第一组叉指换能器2包括100对叉指,指条宽度为20um,声孔径为2mm,在正弦交流电的作用下在压电基底1上产生频率为48.5mhz的声表面波;所述的第二组叉指换能器3包括100对叉指,指条宽度为10um,声孔径为2mm,在正弦交流电的作用下在压电基地1产生频率为99mhz的声表面波。

所述的pdms微流道系统中所有流道的高度均为70um,流道各部分的宽度如下:第一鞘流液流入通道4宽度为150um,血细胞样品液流入通道5宽度为300um,第二鞘流液流入通道6宽度为250um,白细胞分选流道7宽度为500um,白细胞收集通道8宽度为300um,红细胞与血小板流入通道9宽度为240um,第三鞘流液流入通道10宽度为300um,红细胞分选流道11宽度为500um,红细胞收集通道12宽度为300um,血小板收集通道13宽度为240um;其中第一鞘流液流入通道4、第二鞘流液流入通道6、白细胞收集通道8、第三鞘流液流入通道10、红细胞收集通道12均为圆弧形流道,血细胞样品液流入通道5、白细胞分选流道7、红细胞与血小板流入通道9、红细胞分选流道11和血小板收集通道13均为直流道。

所述的压电衬底1材料为128°y切铌酸锂(128°y-cutlinbo3)。

所述的两组叉指换能器均采用50纳米底层铬和200纳米上层金的双层结构,其中铬作为增强金与压电基底1粘附强度的粘附层,金作为导电层。

所述的pdms微流道系统采用具有良好透光性与生物兼容性的聚二甲基硅氧烷(pdms)制作,便于对全血细胞分选过程进行光学检测与记录。

所述的一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片的分选方法,包括以下步骤:

1)将基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片固定在显微镜的载物台上,通过目镜观察确保微流道系统中的白细胞分选流道7和红细胞分选流道11处于显微镜视场内并且无倾斜;

2)将第一鞘流液流入通道4连接的鞘流液流进接头、第二鞘流液流入通道6连接的鞘流液流进接头、第三鞘流液流入通道10连接的鞘流液流进接头通过特氟龙导管分别与氮气压力注射泵上的三个pbs溶液储液瓶相连接,将血细胞样品液流入通道5连接的血细胞样品液流进接头通过特氟龙导管与氮气压力注射泵上的待分离血细胞样品液储液瓶相连接,将白细胞出口接头、红细胞收集接头、血小板收集接头通过特氟龙导管分别与白细胞收集容器、红细胞收集容器、血小板收集容器相连接;将第一鞘流液流入通道4连接的鞘流液流进接头、血细胞样品液流入通道5连接的血细胞样品液流进接头、第二鞘流液流入通道6连接的鞘流液流进接头以及第三鞘流液流入通道10连接的鞘流液流进接头的压力输入分别设置为12mbar、22mbar、33mbar、35mbar;

3)将两台信号发生器的信号输出口的正负两极分别与第一组叉指换能器2和第二组叉指换能器3的正负两极相连接,调节两台信号发生器的输出信号为正弦连续输出,连接第一组叉指换能器2的信号发生器输出电压为20-40vpp,输出频率为48.5mhz;连接第二组叉指换能器3的信号发生器输出电压为20-40vpp,输出频率为99mhz;其中声表面波行波场的声辐射力大小与叉指换能器的频率以及细胞的粒径成正比,第一组叉指换能器2所激发的频率为48.5mhz的声表面波用于实现白细胞的偏转,红细胞和血小板保持原来运动状态,第二组叉指换能器3所激发的频率为99mhz的声表面波用于实现红细胞偏转,血小板保持原来运动状态;

4)开启注射泵,通过调节第一鞘流液流入通道4、血细胞样品液流入通道5、第二鞘流液流入通道6以及第三鞘流液流入通道10入口端压力,使血细胞样品液和鞘流液形成稳定层流,然后打开信号发生器输出开关,进行全血细胞分选。

分选过程如图2、图3a和图3b所示,图2中的大、中、小圆点分别代表白细胞、红细胞、血小板,第一鞘流液流入通道4、第二鞘流液流入通道6、第三鞘流液流入通道10分别通入鞘流液,血细胞样品液流入通道5通入待分离全血细胞样品液,通过氮气压力注射泵调节第一鞘流液流入通道4、第二鞘流液流入通道6、第三鞘流液流入通道10以及血细胞样品液流入通道5的入口端压力,在白细胞分选流道7和红细胞分选流道11中使血细胞样品液和两侧鞘流液形成如图3a虚线所示第一稳定层流ⅰ和图3b虚线所示的第二稳定层流ⅱ,血细胞样品液被鞘流液挤压在图3a和图3b所示虚线内;两组叉指换能器施加交流电,根据逆压电效应在压电基底上产生声表面波,血细胞在白细胞分选流道7和红细胞分选流道11中主要受到声辐射力、流体粘性力、重力以及浮力四种力作用,血细胞所受重力和浮力基本可以抵消,声辐射力与细胞体积成正比,流体粘性力与细胞半径成正比,因此细胞粒径越大,声辐射力作用效果越明显;在白细胞分选流道7中,第一组叉指换能器2激发频率为48.5mhz的声表面波,白细胞受到较大的声辐射力越过第一稳定层流ⅰ偏转到白细胞收集通道8中,红细胞与血小板粒径较小所受声辐射力作用效果不明显,能够保持原来运动轨迹进入红细胞分选流道11,在红细胞分选流道11中,第二组叉指换能器3激发频率为99mhz的声表面波,红细胞受到较大声辐射力越过第二稳定层流ⅱ偏转到红细胞收集通道12,血小板所受声辐射力作用效果不明显,能够保持原轨迹进入血小板收集通道13中。

所述的一种基于声表面波的微流控全血细胞多级分选芯片的制备方法,包括下列步骤:

1)利用光刻狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台在洁净的铌酸锂衬底表面制作一层带有两组叉指换能器图案的光刻胶;

2)采用溅射+剥离的工艺在铌酸锂衬底表面制作两组叉指换能器;

3)采用光刻狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台在硅衬底上制作su8模具;

4)利用su8模具制作pdms材质的pdms微流道系统,并进行出入口接头处理;

5)将经等离子体清洗的pdms微流道系统与铌酸锂衬底对齐后在150℃保温2小时后完成键合。

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