一种从土壤中分离抗烟草花叶病毒细菌的方法与流程

文档序号:19583829发布日期:2019-12-31 20:21

本发明涉及微生物生态学狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台领域,尤其涉及一种从土壤中分离抗烟草花叶病毒细菌的方法。



背景狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台:

烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,tmv)是烟草花叶病等的病原体,具有广泛的寄主范围,可侵染十字花科、茄科和葫芦科等至少9个科125种植物,其发生频率高、流行快、为害重、难治理,一旦植物染病,无法得到有效的控制,极易引发病毒病的流行,造成严重的经济损失。每年因烟草花叶病毒造成的经济损失高达数十亿美元。目前在病毒病害治理中主要采用抗病毒品种的选育、传毒媒介防控及交叉保护等方式,而针对植物病毒病的有效化学农药种类少,亟待农业科研人员去解决。

已有研究,植物病毒被细菌污染后其汁液会很快失去侵染活力,随后一些科研工作者开始致力于微生物及其代谢产物抗病毒活性的研究。目前已发现,有许多细菌和真菌及其代谢物质都具有一定钝化烟草花叶病毒病毒粒子的能力,但如何分离抗烟草花叶病毒细菌还没有较好的方法。

因此,针对上述问题,有必要提出进一步地解决方案。



狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台实现要素:

本发明旨在提供一种从土壤中分离抗烟草花叶病毒细菌的方法,以克服现有狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台中存在的不足。

为解决上述狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台问题,本发明的狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台方案是:

一种从土壤中分离抗烟草花叶病毒细菌的方法,包括以下步骤:

(1)取1.0g土样,放入瓶内,加入无菌水,密封后震荡培养1-3h;

(2)将所述步骤(1)中震荡培养后的溶液静置20-60min后,取上清液梯度稀释,混合均匀后每个浓度取80-120μl分别均匀涂布于培养基的平板上;

(3)将平板在25-30℃恒温培养箱中培养15-20h;

(4)取出培养后的平板,从中选择细菌菌落分布均匀的平板,挑取单斑放至2-5ml培养液中震荡培养10-20h,形成菌液;

(5)取1ml菌液,离心8-12min,取上清液与等体积烟草花叶病毒接种液混合,室温静置15-30min形成混合液;

(6)取烟草花叶病毒接种液与等体积磷酸盐缓冲溶液混合,室温静置15-30min形成对照混合液;

(7)以三生烟为实验材料,在三生烟叶片上均匀撒布石英砂,以三生烟叶的主脉为界限,轻轻摩擦混合液于半片叶片;另外半片叶片摩擦对照混合液;

(8)摩擦混合液和对照混合液15-30min后,用无菌水喷洒清洗叶片,室温条件下自然风干;

(9)温室中隔离培养2-4d,然后计数叶片上枯斑的数目,实验数据进行单因素方差分析,进行差异显着行分析,按照以下公式统计抗病毒效果:

优选地,所述步骤(1)中加入7-12ml无菌水。

优选地,所述步骤(1)和/或步骤(4)在25-30℃下以100-140rpm进行震荡。

优选地,所述步骤(2)中取上清液梯度稀释100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5

优选地,所述培养基采用lb固体培养基。

优选地,所述培养液为lb液体培养基。

优选地,所述土样取自浅海海泥或烟草根际土壤。

优选地,所述三生烟在光照时长16h,光照强度2000lux,黑暗时长8h,温度25±1℃,相对湿度60%的条件下培养。

优选地,所述步骤(7)采用培养四周的三生烟。

优选地,所述烟草花叶病毒接种液的制备方法包括以下步骤:

(1)取部分侵染烟草花叶病毒的烟草叶,用10mmol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液研磨、匀浆;

(2)将所述步骤(1)中产生的浆液用双层纱布过滤,并离心;

(3)取所述步骤(2)离心后的上清液,用聚乙二醇处理两次后再次离心;

(4)所述步骤(3)最终离心后,取其沉淀,用10mmol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液重悬,即得到烟草花叶病毒接种液。

优选地,烟草花叶病毒接种液的制备在4℃条件下操作。

与现有狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台相比,本发明的有益效果是:

本发明公开了一种从土壤中分离抗烟草花叶病毒细菌的方法,从不同生境(浅海海泥和烟草根际土壤)采集的样品中分离对烟草花叶病毒病毒具有抑制作用的细菌,丰富抗病毒有益细菌的种类,并进一步简单测定抗病毒效果,为抗烟草花叶病毒细菌的利用奠定了基础。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定,本文使用的所有狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台以及科学术语具有与本发明所属领域普通狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时,以本说明书中的定义为准。如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。例如,包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素,而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中,此短语将使权利要求为封闭式,使其不包含除那些描述的材料以外的材料,但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时,其仅限定在该子句中描述的要素;其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开了范围“1至5”时,所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象,除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生,而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量,表示本发明并不限定于该具体数量,还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的,用“大约”、“约”等修饰一个数值,意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中,近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中,范围限定可以组合和/或互换,如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

此外,本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个,并且单数形式的要素或组分也包括复数形式,除非所述数量明显旨指单数形式。

实施例1:

本申请实施例中所用植物材料为烟草花叶病毒的枯斑寄主三生烟(nicotiana.tabacumcv.sunsamnn),由本申请人留种繁殖,培养于温室中。植物培养条件:光照16h,温度25±1℃,光照强度2000lux,相对湿度60%;黑暗时长8h,温度25±1℃,相对湿度60%。所用营养基质由山东省寿光市沃德营养土加工厂生产,植物生长期间无需额外施肥。

烟草花叶病毒毒源采集于山东省青岛市,并于温室中栽培的普通烟草nc89上繁殖保存。

土样分别采集自烟草根际土壤、浅海海泥。

烟草花叶病毒接种液的制备:采用gooding&helbert(1967)方法并稍作改进制备烟草花叶病毒溶液。取系统侵染烟草花叶病毒的nc89上部新叶,用10mmol/l的磷酸盐缓冲液(ph7.4)研磨、匀浆;然后用双层纱布过滤,并离心(1000×g,20min);取上清,用聚乙二醇处理两次。再次离心(10000×g,30min)后;沉淀用10mmol/lpbs缓冲液(ph7.4)重悬,即得到烟草花叶病毒接种液。整个操作需要在4℃条件下进行,然后用分光光度计测定260nm波长的吸光度值,根据公式计算病毒浓度。

病毒浓度(mg/ml)=(a260×稀释倍数)/e0.1%1cm260nm

注:e为消光系数,即波长260nm时,浓度为0.1%(1mg/ml)的悬浮液在光程为1crn时的光吸收(光密度)值。烟草花叶病毒的e0.1%1cm260nm为3.1,病毒母液浓度为10μg/ml。

一种从土壤中分离抗烟草花叶病毒细菌的方法,包括以下步骤:

(1)取1.0g土样,放入无菌的锥形瓶内,加入9ml无菌水(超净台中操作),密封后震荡培养2h(28℃,120rpm)。

(2)取出后,放在超净台中静置30min,取上清梯度稀释100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5,混匀后每个浓度取100μl均匀涂布在lb固体培养基的平板上。

(3)lb平板在28℃恒温培养箱中培养16h。

(4)取出,选择细菌菌落分布均匀(菌落数量适中)的平板,挑取单斑放至3mllb液体培养基中震荡培养16h(28℃,120rpm)。

(5)取1ml菌液,6000×g离心10min,取上清与等体积烟草花叶病毒接种液混合,室温静置20min。

(6)取烟草花叶病毒接种液与等体积磷酸盐缓冲溶液混合,室温静置20min形成对照混合液;

(7)采用“半叶法”检测菌液的抗病毒效果:以培养4周的三生烟(nn)为实验材料,在三生烟叶片上均匀撒布石英砂,然后用无菌棉签蘸取混合液,以主脉为界限,轻轻摩擦于半片叶片;另外半片叶片摩擦对照组接种混合液;

(8)摩擦20min后,用无菌水喷洒清洗叶片,室温条件下自然风干;

(9)温室中隔离(远离健康烟)培养3d,然后计数叶片上枯斑的数目,实验数据用spssv18.0进行邓肯新复极差法进行单因素方差分析,进行差异显着行分析,按照以下公式统计抗病毒效果:

实施例2:

(1)取1.0g土样,放入无菌的锥形瓶内,加入11ml无菌水(超净台中操作),密封后震荡培养3h(26℃,130rpm)。

(2)取出后,放在超净台中静置50min,取上清梯度稀释100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5,混匀后每个浓度取110μl均匀涂布在lb固体培养基的平板上。

(3)lb平板在26℃恒温培养箱中培养20h。

(4)取出,选择细菌菌落分布均匀(菌落数量适中)的平板,挑取单斑放至4mllb液体培养基中震荡培养20h(26℃,130rpm)。

(5)取1ml菌液,6000×g离心10min,取上清与等体积烟草花叶病毒接种液混合,室温静置25min。

(6)取烟草花叶病毒接种液与等体积磷酸盐缓冲溶液混合,室温静置25min形成对照混合液;

(7)采用“半叶法”检测菌液的抗病毒效果:以培养4周的三生烟(nn)为实验材料,在三生烟叶片上均匀撒布石英砂,然后用无菌棉签蘸取混合液,以主脉为界限,轻轻摩擦于半片叶片;另外半片叶片摩擦对照组接种混合液;

(8)摩擦25min后,用无菌水喷洒清洗叶片,室温条件下自然风干;

其它步骤与实施例1相同。

综上所述,本发明公开了一种从土壤中分离抗烟草花叶病毒细菌的方法,从不同生境(浅海海泥和烟草根际土壤)采集的样品中分离对烟草花叶病毒病毒具有抑制作用的细菌,丰富抗病毒有益细菌的种类,并进一步简单测定抗病毒效果,为抗烟草花叶病毒细菌的利用奠定了基础。

对于本领域狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

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