一种广藿香内生真菌的分离筛选方法与流程

文档序号:19583828发布日期:2019-12-31 20:21
一种广藿香内生真菌的分离筛选方法与流程

本发明涉及微生物狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台领域,特别涉及一种广藿香内生真菌的分离筛选方法。

狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台背景

广藿香(pogostemoncablin(blanco)benth.)为唇形科刺蕊草属植物,以干燥地上部分入药,为广东道地药材,“十大广药”之一。药用植物内生真菌广泛存在于药用植物体内,具有丰富的生物多样性,对寄主植物有着积极的作用,其次生代谢产物有着抗肿瘤、抗氧化、抗菌等活性,在医药、农业等方面有着巨大的应用前景。

经调查发现,番茄种植过程中得青枯病,青枯病病害会在短时间内迅速传播,且后期的控制工作也是非常困难的,造成番茄作物大面积萎蔫死亡甚至绝收,最终导致番茄产量下降,严重损害了种植户的经济效益。从广藿香植株的根、茎、叶分离出的内生真菌,对寄主植物抑制青枯病有着积极的作用。



狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台实现要素:

本发明的发明目的在于提供一种广藿香内生真菌的分离筛选方法,采用本发明提供的狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台方案为广藿香内生真菌的资源利用和防治青枯病提供了理论基础。

为了达到上述发明目的,本发明提供一种广藿香内生真菌的分离筛选方法,包括以下步骤:

培养基制备步骤,用于制备所述内生真菌分离筛选方法所需的培养基;

内生真菌的分离与纯化步骤,用于从广藿香植株中分离出内生真菌,并纯化得到内生真菌的菌株;

内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤,用于通过完成纯化得到的菌株发酵并浓缩得到内生真菌的粗提取物;

内生真菌的活性筛选步骤,用于对内生真菌的粗提取物筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。

优选的,在培养基制备步骤中,所述培养基包括:

由马铃薯、葡萄糖和琼脂培养形成的pda培养基;

由马铃薯、葡萄糖、kh2po4、mgso4·7h2o、维生素b1和水培养形成的pdb液体培养基;

由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和琼脂培养形成的na培养基;以及

由蛋白胨、牛肉膏和氯化钠培养形成的na液体培养基。

优选的,所述内生真菌的分离与纯化步骤包括以下步骤:

a100、采集健康的广藿香植株,清洗并切成小块制成样品;

a200、将样品依次浸泡于乙醇、naclo溶液和乙醇完成消毒杀菌,再用无菌水冲洗;

a300、将完成冲洗的样品置于pda培养基中恒温培养;待样品长出菌丝,及时挑出pda培养基中的单一菌丝至新的pda培养基中恒温培养,并反复操作a300,直至获得纯化的若干内生真菌菌株。

优选的,内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤包括以下步骤:b100、将步骤a300中纯化得到的内生真菌菌株接种到pda培养基中;

b200、发酵若干天后加入乙酸乙酯浸泡;

b300、将浸泡后的pda培养基捣碎再次浸泡,依次过滤并减压浓缩得到内生真菌的粗提取物。

优选的,所述内生真菌的活性筛选步骤包括以下步骤:

c100、取适量步骤b300中得到粗提取物,用dmso溶液配制成样品溶液;

c200、将青枯菌分别培养于若干个na液体培养基中,经恒温培养摇床振荡培养配制成菌液;

c300、蘸取适量菌液分别均匀涂布于若干个na培养基上,在灭过菌的滤纸片上滴加样品溶液,并将上述滤纸片置于含菌液的na培养基上;

c400、将na培养基恒温培养,测量其抑菌圈的直径大小,并筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。

优选的,所述pda培养基的制备方法包括由质量浓度比为200~220:20~25:15~20:10-7的马铃薯、葡萄糖、琼脂和硫酸卡那霉素和氨苄青霉素,自然ph值,在121℃高温高压环境中灭菌40~45min培养形成;

所述pda液体培养基的制备方法包括由质量浓度比为200~220:20~25:2~5:0.1~0.2:0.01:1的马铃薯、葡萄糖、kh2po4、mgso4·7h2o、维生素b1和水,自然ph值,在121℃高温高压环境中灭菌25~35min培养形成;

所述na培养基的制备方法包括由质量浓度比为8~11:2~4:4~6:15~20的蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和琼脂,在121℃高温高压环境中灭菌25~35min培养形成;

所述na液体培养基的制备方法包括由质量浓度比为8~12:2~3:5~7的蛋白胨、牛肉膏和氯化钠,在121℃高温高压环境中灭菌25~35min培养形成。

优选的,在步骤a300中,对获得的内生真菌菌株进行分子生物学鉴定,包括:

a301、先对获得的内生真菌菌株初筛选出2株高效菌培养72h,按tsp101试剂盒提取dna;

a302、通过琼脂糖电泳观察后,用通用引物对菌株进行基因组pcr扩增;

a303、将扩增后的产物进行基因its测序,将测序结果在genbank中通过blast进行比对。

优选的,在步骤b200中,在28℃环境下发酵30~40天后,加入乙酸乙酯浸泡2~3h;

在步骤b300中,将浸泡后的pda培养基捣碎再次浸泡12~13h,过滤后,在40~50℃,60r/min下减压浓缩得到内生真菌的粗提取物。

优选的,在步骤c200中,所述na液体培养基在30℃恒温培养振荡器中振荡培养36h;

在步骤c400中,na培养基置于30℃恒温培养24h。

由上可知,应用本发明提供的可以得到以下有益效果:采用组织块分离法从广藿香植株分离内生真菌,以期获得多种类型的对青枯菌具有拮抗作用的菌株,用形态观察进行拮抗菌的菌株鉴定,用盆栽试验测生防菌剂对青枯病菌的生物防控效果,并研究其在青枯病生物防治中的相关应用,为广藿香内生真菌的资源利用和防治青枯病提供理论基础,为番茄青枯病生物防治中提供了可供参考的新的菌株资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台中的狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台方案,下面将对本发明实施例或现有狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台的描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一部分实施例,对于本领域普通狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例广藿香内生真菌的分离筛选方法流程框图;

图2为本发明实施例内生真菌的分离与纯化步骤流程框图;

图3为本发明实施例内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤流程框图;

图4为本发明实施例内生真菌分子生物学鉴定步骤流程框图;

图5为本发明实施例内生真菌的活性筛选步骤流程框图;

图6为本发明实施例gy14菌株抗青枯菌的抑菌圈图;

图7为本发明实施例gy06菌株抗青枯菌的抑菌圈图;

图8为本发明实施例gy14菌株抗金黄色葡萄球菌的抑菌圈图;

图9为本发明实施例gy06菌株抗大肠杆菌的抑菌圈图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1所示,为了解决青枯菌影响农作物收成的狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台问题,本实施例提供一种广藿香内生真菌的分离筛选方法,能够分离形成具有高抗青枯病的内生真菌。由于广藿香根、茎、叶均有内生真菌,但不同部位含有内生真菌的种类和数量是不一样的。本实施例提供的分离筛选方法采用组织块分离法分离和纯化获得高抗青枯病的内生真菌,如图2所示,包括以下步骤:

a100、采集健康的广藿香植株,清洗并切成小块制成样品;

采集健康的广藿香并用蒸馏水清洗,分别把根、茎、叶切成不同规格若干小块制成样品。

a200、将样品依次浸泡于乙醇、naclo溶液和乙醇完成消毒杀菌,再用无菌水冲洗;

将样品依次放入75%乙醇中浸泡1-2min,3%naclo溶液浸泡2-3min,75%乙醇浸泡1-2min,然后用无菌水冲洗,并置于pda固体培养基中26℃恒温培养。

a300、将完成冲洗的样品置于pda培养基中恒温培养;待样品长出菌丝,及时挑出pda培养基中的单一菌丝至新的pda培养基中恒温培养,并反复操作a300,直至获得纯化的若干内生真菌菌株。

其中,pda培养基的制备方法包括由质量浓度比为200~220:20~25:15~20:10-7的马铃薯、葡萄糖、琼脂和硫酸卡那霉素和氨苄青霉素,自然ph值,在121℃高温高压环境中灭菌40~45min培养形成。在步骤a300在,为了使得菌丝在培养基内生长,pda培养基放置在26℃恒温的环境中培养。

为了确保获得的菌株为广藿香的内生真菌,在内生真菌分离的过程中,将表面消毒过的上述材料不经任何剪切,直接接种于相同的pda培养基上培养,观察其是否有菌生长,以此作为空白对照,若其上面没有菌株生长,则表明上诉步骤分离得到为广藿香的内生真菌。

分离纯化后得到的菌株进行固体发酵培养,并且制备其粗提物。请参见图3,内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤包括以下步骤:

b100、将步骤a300中纯化得到的内生真菌菌株接种到pda培养基中;

在该步骤中将纯化得到的内生真菌菌株接种到pda培养基中,在28℃下进行固体发酵30天。

b200、发酵30天后,加入乙酸乙酯浸泡2~3h;

b300、将浸泡后的pda培养基捣碎再次浸泡,依次过滤并减压浓缩得到内生真菌的粗提取物。

在步骤b300中,将浸泡后的pda培养基捣碎再次浸泡12~13h,过滤后,在40~50℃,60r/min下减压浓缩得到内生真菌的粗提取物。

进一步的,对得到的内生真菌粗提取物做活性筛选,为了得到具有抗青枯菌的内生真菌。在筛选之前需制备若干na液体培养基和若干na培养基。

其中,na液体培养基又马铃薯200g/l,葡萄糖20g/l,kh2po43g/l,mgso4·7h2o0.15g/l,维生素b110mg/l,水1000ml,ph自然,121℃下高压灭菌30min培养形成。

na培养基由蛋白胨10g/l,牛肉膏3g/l,氯化钠5g/l,琼脂18g/l,121℃下高压灭菌30min培养形成。

如图4所示,本实施例采用滤纸片法进行内生真菌活性的筛选,内生真菌的活性筛选步骤包括以下步骤:

c100、取适量步骤b300中得到粗提取物,用dmso溶液配制成浓度为50mg/ml的样品溶液;

c200、将青枯菌分别培养于若干个na液体培养基中,经恒温培养摇床振荡培养配制成菌液;

其中,na液体培养基放置在30℃恒温培养振荡器中振荡培养36h,然后用生理盐水稀释配制成105-107cfu/ml的菌液。

c300、蘸取适量菌液分别均匀涂布于若干个na培养基上,在灭过菌的滤纸片上滴加样品溶液,并将上述滤纸片置于含菌液的na培养基上;

c400、将na培养基恒温培养,测量其抑菌圈的直径大小,并筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。

将na培养基置于37℃恒温箱培养24h,测量其抑菌圈的直径大小,可以根据抑菌圈的直径大小来判断内生真菌抑制作用的效果,进而挑选出抗青枯菌的内生真菌。

本实施例采用组织块分离法从样本中共分离得到42株内生真菌,其中从根部分离得到10株,茎部分离得到16株,叶部分离得到16株,分别占分离菌株数的23.8%,38.1%,38.1%。从不同部位分离得到的菌株数可以看出,根部的分离率最低,而叶和茎的分离率相等,均高于根部。

对分离得到的42株内生真菌广藿香内生真菌进行抑菌活性筛选,得到6株具有青枯菌活性的菌株,取名分别为gj06、gg05、gy06、gj13、gg03、gy14。

表1具青枯菌拮抗活性广藿香内生真菌

结果见表1,其中gy06抑菌半径为6.6mm,gy14抑菌半径为7.1mm、gg05抑菌半径为4.5mm,而其余的gj06、gj13、gg03的抑菌半径较小。如图6-7所示,分别为gy14菌株、gy06菌株抗青枯菌的抑菌圈,可看出gy06菌株、gy14菌株的抑制青枯菌效果较为显着。

实施例2

本实施例对上述分离得到的内生真菌进行抑菌活性试验以及提供内生真菌的鉴定方法。

对实施例1中分离得到的内生真菌进行抑菌活性试验,将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌配制成菌液,用棉签蘸取适量金黄色葡萄球菌液和大肠杆菌液分别均匀涂布于na培养基上,每个菌种分别设置若干个平板培养基。

具体的,将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别培养于na液体培养基中,37℃恒温培养摇床中振荡培养24h,用生理盐水稀释,配制成105-107cfu/ml浓度菌液。其中,na液体培养基采用以下质比原料调制:蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l,121℃下高压灭菌30min,并且每个菌种分别设置若干个平板培养基,用于测试上述分离出的多种内生真菌菌株的活性。

取棉签蘸取适量菌液,均匀涂布于na培养基上,在灭过菌的滤纸片上分别滴加内生真菌样品溶液4~5ul,用无菌镊子夹取上述滤纸片置于含有金黄色葡萄球菌液和大肠杆菌液的平板培养基上,将平板置于37℃恒温箱培养24h,测量其抑菌圈的直径大小,计算抑菌圈的平均直径。

以dmso溶液作为空白对照,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别以浓度200μg/ml的氨苄青霉素、浓度为200μg/ml的硫酸卡那霉素作阳性对照。有活性的广藿香内生真菌株将会对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制生长的作用,可以根据抑菌圈的直径大小来判断抑制作用的效果。

表2菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用

表3菌株对大肠杆菌的抑制作用

试验结果见表2,具有抑制金黄色葡萄球菌的菌株有5株,如图8所示,其中菌株gy14抑菌效果最好,抑菌半径达到7.5mm,菌株gg05、gy04、gj06的抑菌效果次之,菌株gy03的抑菌效果相对较差。

试验结果见表3,具有抑制大肠杆菌的菌株有4株,如图9所示,其中菌株gy06的抑制效果最好,抑菌半径达到13mm,菌株gy14和菌株gj06的抑菌效果次之,菌株gy04的抑制效果相对较差。

植物内生真菌种类丰富多样,不同的植物能够分离得到不同种类和数量的内生真菌。在不同的实验环境和分离方法之下,由同一植物分离得到的内生菌也是有差异的。本发明实施例采用组织块分离法从广藿香的根、茎和叶片中分离出42株内生真菌,从中通过抑菌试验筛选出5株对金黄色葡萄球菌和4株对大肠杆菌有拮抗活性的菌株,由试验结果可以得出结论,菌株gy14和菌株gj06的拮抗活性尤为显着。

为了对获得并筛选出的2株高效内生真菌-菌株gy14和菌株gj06进行分子生物学鉴定,本实施例提供对获得的内生真菌菌株进行分子生物学鉴定方法,包括以下步骤:

a301、先对获得的内生真菌菌株初筛选出2株高效菌培养72h,按tsp101试剂盒提取dna;

a302、通过琼脂糖电泳观察后,用通用引物对菌株进行基因组pcr扩增;

a303、将扩增后的产物进行基因its测序,将测序结果在genbank中通过blast进行比对。

通过基因组检测电泳结果可以看出2个样品dna的分离效果均较好,无断裂,浓度可观,可进行下一步分析。从pcr扩增后检测的电泳图可以看出,5个样品均能分离出条带,并且条带都很清晰,分离效果较好,浓度也较高。

经生物狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台测序,内生真菌gy06的基因组its序列如下:

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通过blast进行比对分析,发现内生真菌gy06与黄丝曲霉属(talaromycessp12mgs-2017)相似覆盖度达99%。初步确定该菌属于黄丝曲霉属。

经生物狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台的测序,内生真菌gy14的基因组its序列如下:

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通过blast进行比对分析,发现内生真菌gy14与广藿香内生真菌属(cerrenaspmg295)相似覆盖度达99%。初步确定该菌属于齿毛菌属。

实施例3

根据以上分离筛选得到的广藿香内生真菌,本实施例还提供盆栽试验,试验广藿香内生真菌gy14菌株和gy06菌株对青枯菌的抗病效果。

青枯菌侵染可导致番茄、辣椒、广藿香等多种植物出现青枯病。采用伤根浸泡法和灌根法对健康番茄幼苗进行接种试验。将试验盆栽分为4组,分别为只接种清水的空白组、接种青枯菌的对照组、接种gy14菌株和青枯菌的实验组1、接种gy06菌株和青枯菌的实验组2。

具体的,挑选生长情况一样、大小相同、发育良好的番茄幼苗,用无菌水清洗干净后,用无菌手术刀在插扦苗切割出相同程度的伤口后,将其浸泡在青枯菌悬浮液中15分钟。将浸泡过的插扦苗放回育苗盆,对照组加入25ml的青枯菌悬浮液,实验组1和实验组2加入25ml的抗青枯菌内生菌的悬浮液,空白组只接种清水,即:

实验组1,番茄幼苗接种青枯菌,同时加入25ml菌株gy14的内生菌悬浮液;

实验组2,番茄幼苗接种青枯菌,同时加入25ml菌株gy06的内生菌悬浮液;

对照组,番茄幼苗接种青枯菌,加入25ml的青枯菌悬浮液;

空白组,番茄幼苗不接种青枯菌,只加入清水。

培养7天后观察并记录番茄幼苗青枯病的发病情况。

将番茄幼苗青枯病的发病情况分为5级:0级为叶片没有明显症状;1级为1%~25%的叶片出现萎蔫症状;2级为26%~50%的叶片出现萎蔫症状;3级为51%~75%的叶片出现萎蔫症状;4级为76%~100%的叶片出现萎蔫症状。病情指数和防治效果计算方法如下:

病情指数(%)=σ(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)×100;

防病效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

在处理7天后根据盆栽结果显示记录番茄幼苗的发病情况,并通过以上病情指数计算方法,计算得出实验组1、实验组2、对照组以及空白组的病情指数结果如下:

实验组1,用菌株gy14处理番茄幼苗,同时接种青枯菌,番茄幼苗青枯病病情指数为20%;

实验组2,用菌株gy06处理番茄幼苗,同时接种青枯菌,番茄幼苗青枯病病情指数为20%;

对照组,只接种青枯菌,未接种菌株gy14和菌株gy06,番茄幼苗的青枯病病情指数为40%;

空白组,只接清水,未接种菌株gy14、菌株gy06以及青枯菌,番茄幼苗的青枯病病情指数为0。

根据以上实验组1、实验组2、对照组的病情指数,由此可见实验组1和实验组2的病情指数均为20%,对照组的病情指数为40%,通过防治效果计算方法可以计算出菌株gy14的防病效果为50%,菌株gy06的防病效果为50%,结果表明了菌株gy14和菌株gy06具有良好的防病效果。

根据本发明实施例提供的番茄盆栽试验,发现gy14和gy06的防治效果均达到50%,表明了菌株gy14和菌株gy06在实际应用中对青枯病有良好的防治效果。

以上所述的实施方式,并不构成对该狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等,均应包含在该狗65足彩下载_狗65体育_狗65是哪个平台方案的保护范围之内。

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